Tarea 6: PCR Pohymerase Chain Reaction - Reacción en cadena de la polimerasa

¿Qué es?

La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (polymerase chain reaction), es una técnica de biología molecular cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde.

¿Para qué sirve?

Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.

¿Cómo funciona PCR?

Hay tres pasos básicos que intervienen en la realización de una PCR. Los pasos se repiten 30-40 veces en ciclos de calentamiento y enfriamiento, con cada paso que tiene lugar a una temperatura diferente.

Componentes necesarios para llevar a cabo una PCR

• Una plantilla de ADN: El ADN a copiar, por lo general extraído y purificado a partir de sangre o de otro tejido.
• Cebadores: oligonucleótidos de cadena sencilla que coincidan exactamente con el inicio y el final de la plantilla de ADN. Estos son generados sintéticamente.
• Una ADN polimerasa (por ejemplo Taq polimerasa): Para sintetizar el ADN.
• dNTPs (desoxirribonucleótidos trifosfato): los bloques de construcción de la que la Taq polimerasa puede sintetizar nuevo ADN. Estos se añaden en una cantidad en exceso.
• Una solución tampón: crea un ambiente óptimo para la reacción que se produzca pulg
• Solución de sal de cloruro de magnesio

Pasos de PCR

Todos los componentes se mezclan juntos en un solo tubo en volúmenes muy pequeños. La reacción se lleva a cabo en una máquina automática, conocida como un termociclador, que es capaz de aumentar y disminuir rápidamente la temperatura.

1. El primer paso se conoce como la etapa de desnaturalización y se lleva a cabo en alrededor de 95°C.

ADN existe en la naturaleza como una molécula de doble cadena unidos entre sí por enlaces de hidrógeno débiles. Para poder copiarlo, hay que separar en hilos individuales (desnaturalizado) ADN. Esto puede hacerse por calentamiento a más de 90°C.

2. La segunda etapa es la etapa de recocido y se lleva a cabo a aproximadamente 55-60°C.

Aunque la temperatura se baja, una cantidad en exceso de cebadores evita que el ADN desnaturalizado de la reforma de la doble hélice. Los cebadores se unen o "recocido" a su secuencia correspondiente en la cadena de ADN inicial.

3. El paso de extensión final se lleva a cabo a 72°C.

Taq ADN polimerasa se une al cebador hibridado. Taq polimerasa se abre camino a lo largo del ADN, la adición de nucleótidos complementarios utilizando los dNTPs y otros componentes en la mezcla de reacción. Esto completa el proceso de replicación.

4. Una vez que la síntesis se ha completado, toda la mezcla se calienta de nuevo a 95 º C para fundir los complejos de ADN recién formadas. Esto da como resultado el doble de la cantidad de plantilla disponible para la siguiente ronda de replicación. Calefacción y refrigeración repetida amplifica rápidamente el segmento de ADN de interés. Alrededor de un millón de copias se hacen después de 20 ciclos.